＜研究概要＞

　電極反応、腐食、結晶成長さらに生体反応といった多くの重要なプロセスが固液界面で起こっている。一般に固体表面の構造や特性はバルクのそれとは異なっているため、固液界面反応の機構を理解するためには、原子レベルで固体表面の幾何構造や電子構造を、また分子レベルで反応物、生成物、中間体、さらには界面に存在する溶媒分子の構造を、反応が実際に起こっている溶液中（その場）で知り、さらにそれらが反応によってどう変化するかを追跡する必要がある。溶液の存在下では、超高真空手法の利用が不可能なため固液界面のその場計測は固気界面に比べて大きく遅れていた。しかしこの20年間に走査型プローブ顕微鏡（STM、AFMなど）やシンクロトロン放射光を利用したＸ線測定法による表面構造の原子レベルでのその場観察法、界面選択的に電子構造および分子構造が決定可能な非線形分光法などが大きく進展し、固液界面に関する理解が大幅に進んだ。私はこれまで一貫して固体／溶液界面あるいは固体／気体界面での発光および励起緩和過程あるいは、そこで起こる化学反応（電気化学反応、（光）触媒反応）を分光学的手法を用いて、分子レベルで明らかにすることを目的として研究を行ってきた。下記にこれまで行ってきた代表的な研究内容を２つ紹介する。

１．時間分解和周波発生（SFG）分光法による白金／溶液界面吸着種の動的挙動の追跡」
　本研究では、SFG分光法と電気化学測定法を組み合わせたシステムを新たに構築し、白金電極／電解質溶液界面に形成された吸着COのピコ秒レーザー励起にともなう反応のダイナミクスを時間分解SFG分光法で追跡した。0.1 M HCHOを含む電解質溶液中で種々の電極電位で観測されたSFGスペクトルを図１に示す。2060 cm^-1付近にPt原子のon-topサイトに吸着したCOに帰属されるピークが観測された。また、電極電位が正になるにつれピーク波数が高波数側へシフトした。HCHOなどのC1化合物の解離吸着によって生成したCOの電気化学的挙動は古くから反射赤外吸収分光等による研究によって良く調べられており、今回得られた電位依存性の結果は、過去のものと良い一致を示した。次に吸着COのピコ秒レーザー励起にともなう動的挙動を追跡するために、時間分解SFGスペクトルの測定を行った（図２）。ポンプ光照射前は、Pt原子のon-topサイトに吸着したCOに由来するSFGピークが2064cm^-1に観測された。ピーク強度はポンプ光照射によって急激に減少し、約16 psと極めて速い時定数で回復した。またポンプ光照射直後に新たに1980 cm^-1付近にブロードなピークが出現した。ポンプ光の強度依存性、励起波長依存性の測定から、この新たなピークの起源は、ポンプ光照射による過渡的な表面温度の上昇により、on-topサイトに吸着していたCOがmultifoldサイトへ過渡的にサイトホップしたものであることが分かった。

２．SFG分光法による固体／溶液界面構造評価
　SFG分光法を用いて、種々の固体／溶液界面の水の構造評価に関する研究を行った。例えば、人工軟骨等に使用される低摩擦性を有する高分子ゲル表面の水の構造をSFG分光法により評価し、低摩擦という物理的現象を界面の水の構造という観点から評価することを試みた。その結果、高分子ゲル表面の低摩擦性には水素結合性の弱い界面水が関与していることを明らかにした。（参考No. 24）さらに、電気化学反応（電極触媒反応）における水の重要性・役割を明らかにすることを目的として、SFG分光法による「金属電極／溶液界面水の分子レベルでの構造評価」に関する研究を行った。0.1 M HClO₄水溶液中で観測された、Pt電極およびAu電極界面の水のSFGスペクトルを図３に示す。２つのブロードなピークが3200 cm^-1および3400 cm^-1付近にそれぞれ観測され、"ice-like water"と呼ばれる３配位の水分子および"liquid-like water"と呼ばれる４配位の水分子にそれぞれ帰属される。Pt電極では"ice-like water"に帰属されるピークが支配的なことから界面の水分子は高度に配向していることが示唆された。一方、Au電極ではで"liquid-like water"に帰属されるピークが支配的なスペクトルが観測された。以上の結果は、PtとAu電極上では界面の水の構造が大きく異なることを示唆するものであり、SFGを用いた本研究によって両者の違いを始めて明確に示すことができた。

　 この度の日本化学会北海道支部奨励賞受賞を大変光栄に思います。今後、より一層努力していこうと決意を新たにしております。本研究は、北海道大学大学院理学研究院化学部門　魚崎浩平教授の御指導の下で行われたものです。教授をはじめ共に研究を行った学生諸氏に深く感謝申し上げますとともに、ご協力、ご助言いただいた多くの学内外の先生方に厚く御礼申し上げます。

　ヘムを補酵素として有するタンパク質（＝ヘムタンパク質）は、古くから活発な研究がなされており、その結果、主要な機能である酸素運搬・貯蔵、電子伝達、酸化反応に関しては、多くの知見が得られていた。しかし、近年、一酸化窒素（NO）や酸素（O₂）や一酸化炭素（CO）と結合することにより酵素活性や遺伝子の発現が変化するヘムタンパク質が相次いで発見され、それまで知られていなかったヘムタンパク質の新たな機能が発見された。これらのタンパク質はいずれもヘムと高い結合能をもつ二原子分子の中から、ある特定の分子と結合した時にのみ応答するという特徴を持つ。これらのタンパク質がどのようにして特定の分子のみを認識し、それに応じて活性を変化させるのか、という点に興味をもち、それを分子レベルで解明すると共にそれを観測するための新たな観測手法の開発を行った。

　1. 気体センサータンパク質の気体選別機構の解明
　CooAと呼ばれるCO濃度に依存してDNAの転写調節を行うタンパク質の気体分子の選別機構をラマン分光法により検討した結果、O₂はヘム鉄に結合しても近傍のアミノ酸残基と水素結合を形成できないため、安定な複合体を形成できず、NOは容易に結合するが、ヘムに配位しているHisがヘム鉄から解離してしまい、ヘムとペプチド鎖の唯一の結合が消失するため、ヘムからタンパク質へのシグナルの伝達が起こらず、唯一COだけがヘムの配位構造を保ちながらヘムに結合し、シグナル伝達物質として機能できるということがわかった。つまり、一本の水素結合や配位結合の有無により、CooAがCOとO₂, NOを選別していることを明らかした。同様の仕組みを別のCOセンサータンパク質であるNPAS2においても見出した。
　また、NPAS2においていくつかの極性残基を非極性の残基に置換した結果、ヘムに配位しているHisがヘムから解離する変異体があり、その変異の位置は三次構造上一方向に並び、ヘムから離れた位置に存在する残基でもヘムの配位に摂動を与えることがわかった。つまり、ヘムを起点とした水素結合のネットワークが形成されており、COがヘムに結合するとそれに伴う構造変化がこの水素結合を通じてDNA結合部位に伝わり、DNAの結合能が変化することが示すことができた。

　 2. シグナル伝達機構を解明のため時間分解紫外共鳴ラマン分光装置の製作
　さらに、このようなシグナル分子の結合によるタンパク質のダイナミクスを明らかにするため、サブナノ秒の時間分解能をもつ時間分解紫外共鳴ラマン分光装置の開発に取り組んだ。これまでは、数ナノ秒の時間分解の測定が限界であったため、ナノ秒以前の時間領域での構造変化を観測することが可能な装置を開発し、CooAの構造変化について検討した。その結果、光解離と同時にTrpとPheのバンドの強度が変化し、この変化は1ナノ秒で最大になった後、減少し、8ナノ秒で強度変化がゼロになることが観測された。これらはヘムの近傍に存在するTrp110及びPhe74またはPhe98の変化によるものと考えられ、COがヘムから解離後、これらの疎水性残基近傍に移動し、そこから8ナノ秒以内に再結合することがわかった。
　以上のようにヘムタンパク質の新たな機能である気体分子のセンシング機構を分子レベルで解明するとともに、タンパク質のダイナミクスを探る新たな手法を開発することで、タンパク質の新たな像を描くことに成功した。

　本研究は、北海道大学大学院理学研究院化学部門構造化学研究室で行われたものであり、石森浩一郎教授をはじめ、多くの先生方のご指導に感謝いたします。また、研究室の学生諸氏との議論は研究を進める上で大きな刺激となりました。現在はこのようにして明らかになってきたセンサータンパク質の性質を利用し、これまでにないタンパク質センサーの構築に向け、研究を開始し始めたところであり、研究はまだまだ道半ばであります。今回の受賞は研究を推進する上で、精神的な大きな支えになってくれました。今後も賞に恥じぬよう研究を進めていきたいと思います。

＜研究概要＞

　私は，ピコ秒・フェムト秒時間分解分光法を用いた凝縮系の光励起ダイナミクスの研究を主に行ってきました。2002年に北海道大学に赴任後は，簡単な有機分子のみではなく，生きた細胞や細菌などのより複雑な系における光励起ダイナミクスを明らかにすることを目的として，時間ゲート法を用いた蛍光寿命イメージングシステムを製作し，蛍光タンパク質が発現した生細胞や色素が染色された高度好塩菌などの蛍光寿命イメージングの測定に成功しました。
　製作した蛍光寿命イメージングシステムは，フェムト秒レーザーを用いて試料を励起し，共焦点顕微鏡を用いてマッピングを行います。画像の各点においてフォトンカウンティングによる蛍光減衰曲線の測定を行い，蛍光寿命画像を得る構成としています。変異型緑色蛍光タンパク質(EGFP)の融合タンパク質を人の癌細胞であるHeLa細胞に発現させ，細胞ストレスに伴う蛍光寿命の変化について検討しました。栄養分を与えずに空気中に放置させストレスを加えると，観測される蛍光寿命が減少することがわかりました。試料調整直後では，蛍光寿命はどの細胞においても約2.5 nsでしたが，栄養分を与えずに空気中に放置しストレスを加えると，時間とともに蛍光寿命は減少し，約1.9 nsと短くなりました。蛍光強度画像では顕著な時間変化は観測されませんでした。これらの結果は，細胞にストレスを加えると蛍光寿命が減少することを示しています。蛍光寿命イメージングによって，ストレスの影響を受けている細胞を見分けることができることを示しています。
　観測された蛍光寿命の変化は，細胞のストレスに伴い発色団の周囲の環境が変化したことに起因します。GFPはポリペプチド鎖の円筒の内部に，発色団が存在する構造を持ち，発色団を取り囲むアミノ酸残基による局所電場が，発色団の無輻射緩和過程である構造変化を伴う分子内電荷移動に影響を与えています。電荷移動速度は外部電場の影響を受けることから，細胞ストレスに伴う発色団周囲の局所電場の変化が，無輻射緩和速度の変化を誘起していると考えられます。そこで実際にGFPの蛍光減衰曲線の外部電場効果の測定を行ない，外部電場によって蛍光寿命が減少することを示しました。細胞ストレスに伴う蛍光寿命の減少は，発色団周囲の局所電場の変化が原因であることを示唆しています。
　EGFPの発色団は，ピコ秒の蛍光寿命を持つ中性種とナノ秒の蛍光寿命を持つアニオン種の平衡状態からなり，その存在比はpHに依存します。そのためアニオン種と中性種の両方の蛍光が観測される蛍光波長を選ぶと，pHによる平衡状態の変化を蛍光寿命の変化として観測することができます。我々はこの現象を単一細胞に応用し，蛍光寿命を用いた単一細胞内pH計測を提案しました。HeLa細胞内におけるEGFPの蛍光寿命の細胞内pH依存性について検討を行い，細胞内pHが小さくなるにつれて，蛍光寿命の値が短くなることがわかりました。細胞内におけるEGFPの蛍光寿命とpHの検量線を作成し，その後求めたい細胞の蛍光寿命を観測すれば，蛍光寿命を用いて細胞内pHを検出できることがわかります。
　蛍光寿命を用いた単一細胞内pH計測は，高度好塩菌にも応用しています。フルオレセイン誘導体であるBCECFによって染色された高度好塩菌の蛍光寿命画像の測定を行うと，BCECFの蛍光寿命がpHと相関関係を持つことを用いて，細菌一つ一つのpHを区別して得られることがわかりました。
　"蛍光寿命"というパラメーターから，単一細胞内の様々な情報が得られることを示しました。今後も，今まで行ってきたパルスレーザーを用いた分子分光技術と生命科学における計測技術とを組合せることによって，単一生細胞に適用可能な新たなイメージング手法の開発および細胞内の生理現象の分子レベルでの解明を行っていきたいと考えています。
　この度の北海道支部奨励賞の受賞を非常に光栄に存じます。本研究は北海道大学電子科学研究所 電子材料物性部門 光電子物性研究分野にて行われたものであります。ご指導を頂いた太田信廣教授に深く感謝致します。細胞試料の調整につきましては，北海道大学大学院先端生命科学研究院の加茂直樹教授，金城政孝教授，松山大学薬学部の宮内正二教授に大変お世話になりました。厚く御礼申し上げます。最後になりましたが，北海道大学電子科学研究所の飯森俊文助教をはじめ，ご協力・ご助言を頂いた先生および学生の皆様に感謝申し上げます。

＜研究内容＞
「 唾液アミラーゼの活性測定と精製」
石若 理、小林 央昌、湯谷 敬輔、谷口 友彰、藤井 佑梨奈 小野寺 瞬、谷内 颯樹

1 はじめに
　 私たちは、3年間行ってきたタンパク質の研究を通して、電気泳動の原理を利用したタンパク質の精製方法を確立した。今年度はその方法を利用して唾液、すい液、尿および血液から検出され、デンプンを糖に分解することが知られている消化酵素アミラーゼの精製を試みたので報告する。

2 実験方法
アミラーゼの活性測定
　アミラーゼはデンプンを糖に分解することが知られているので、基質のデンプンが酵素のアミラーゼとの反応後にどれだけ残っているかをヨウ素デンプン反応で検出して、アミラーゼの活性測定を試みた。
電気泳動
　タンパク質はアミノ酸が多数ペプチド結合した重合体で、構成するアミノ酸や立体構造の違いで正または負の電荷を持つことを利用してタンパク質を分離した。
タンパク質のゲルからの抽出
　電気泳動後のゲル中にアミラーゼ活性が確認できた部分から切り出したゲルから自作の抽出装置を利用してタンパク質を抽出した。

3 実験結果 　
アミラーゼの活性測定条件の検討
　 0.001%〜0.100%の範囲で調製したデンプン溶液にヨウ素液を加えて青紫色の濃さを測定した。その結果、0%〜0.050%まではほぼ比例関係にあったので、アミラーゼとの反応後に残存するデンプン濃度が0%〜0.050%の範囲であれば、アミラーゼ活性を測定可能であることがわかった(図1)。

　

唾液アミラーゼの精製
(1)唾液のアミラーゼ活性
　まず、唾液中にアミラーゼが存在するかどうかを確かめるためにアミラーゼの活性測定を行った。対照としてリン酸緩衝溶液(PBS)を用いた方はヨウ素デンプン反応を示し、唾液の方は示さなかった。このことより唾液中にアミラーゼが含まれることがわかった(図2)。

(2)NATIVE電気泳動
　(1)で唾液中にアミラーゼが存在することがわかったので、唾液からアミラーゼを精製しようと考えた。まず、未変成の状態でタンパク質を泳動できるNATIVE電気泳動という方法で唾液中のタンパク質を調べた(図3a)。
　次に、唾液中のタンパク質の中でアミラーゼの場所を特定するために、泳動後のゲルの上に薄いデンプンの膜であるオブラートを静かに乗せて、半日反応させた。その後、ヨウ素デンプン反応を行ったところ、反応しない部分が現れた(図3b)。

(3)タンパク質の抽出とアミラーゼ活性
　(2)で行ったヨウ素デンプン反応で、反応しなかった部分は、ゲル中のアミラーゼとオブラート（デンプン）が反応したと考えた。全泳動距離を1として、反応した部分の移動度を計算したところ、ゲルの先端から0.13〜0.25の位置であった(図3b)。その部分のゲルを切り出し、自作の抽出装置を用いてタンパク質を抽出した。
　抽出したタンパク質にアミラーゼ活性があるかどうかをPBSを対照として調べたところ、明らかにアミラーゼ活性があることが確認できた。
(4)SDS電気泳動
　(3)でアミラーゼ活性が確認された抽出タンパク質が単一のタンパク質なのか確かめるために、SDS電気泳動を行った(図4)。その結果、バンドが2本現れた。また、電気泳動の結果から、縦軸にLog₁₀分子量、横軸に移動度をとり、表計算ソフトExcelを使って近似直線を求め、分子量を計算した。その結果、バンド�@、バンド�Aの分子量は、それぞれ約62,000、約56,000であることが分かった。

4 考察
　ヨウ素デンプン反応は、今まで、デンプンの有無を判断するだけの反応であると思っていたが、今回の実験を通してデンプン濃度によって青紫色の濃さが変化することがわかった。さらに、デンプン濃度が0%〜0.050%の範囲であれば、濃度と色の濃さはほぼ比例するので、ヨウ素デンプン反応がアミラーゼの活性測定に利用可能であることがわかった(図1)。活性測定に関する他の条件についても様々な実験を行った結果、唾液は酵素液中の体積は5μL、反応時間は3分間、溶液のpHは7、反応温度は37℃が最適な条件だとわかった。
　次に、唾液中のアミラーゼの精製を試みた。まず、NATIVE電気泳動後のゲル中のアミラーゼの位置を特定しようと考えた。特定方法として、デンプンと泳動後のゲルを反応させようと考え、さまざまな実験を行った。その結果、湿る程度にPBSを滴下したオブラートとゲルを半日ほど反応させた後にヨウ素液を滴下したところ、ゲル中のタンパク質に反応してオブラートが分解した部分が確認できた（図3b）。オブラートが分解した部分のゲルから抽出した抽出液にはアミラーゼが含まれることがわかった 。次に、抽出したタンパク質の分子量を調べるために、SDS電気泳動を行ったところ、バンドが2本見られた(図4)。通常、タンパク質が精製できた場合、SDS電気泳動をすると、バンドが1本しか見られないので、初めは失敗だと思った。しかし、参考文献でその原因を調べたところ、一部のアミラーゼはオリゴ糖鎖と結合していることがわかった。さらに、この２本のバンドの分子量を計算すると、約62,000と約56,000であり文献の値とほぼ一致したので、私たちが精製した2本のバンドはどちらもアミラーゼであることが明らかになった。

5 今後の課題
　アミラーゼとストレスが関係あるかどうかを調べてみると、ストレスを与えられるとアミラーゼの活性が高まることがわかった。さらに電気泳動の結果から、アミラーゼ活性の高い唾液中ではアミラーゼ濃度が高まっていることがわかった。また、参考文献によると、唾液の分泌には、自律神経系が関係していることがわかった。自律神経系には交感神経と副交感神経がある。一般には、興奮時や緊張時には交感神経が働き、リラックスしている時には副交感神経が働く。ストレスは緊張状態にあるので、交感神経が働いているということになる。また、交感神経が働くと、唾液の分泌が促進されることが知られている。これらのことから、ストレスが働くと、唾液中のアミラーゼ濃度が高まった上に、分泌量が増加するので、唾液中には非常に多くのアミラーゼ分子が存在することがわかった。
　以上により、今後はストレスとアミラーゼの関係についてもう少し調べたい。

6 謝辞
　抽出装置に対する助言をくださった、北海道大学低温科学研究所 落合正則先生に感謝を申し上げる。

○いしわか さとし・こばやし ひろまさ・ゆたに けいすけ・たにぐち ともあき・ふじい ゆりな・ おのでら しゅん・たにうち さつき

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　この度は、奨励賞というとても名誉ある賞を頂きありがとうございました。普段の取組みの成果が評価されてとても嬉しいです。来年もこの賞の受賞を目標に、こつこつと研究を行っていきたいと思います。